Page 147 -

โครงการหนังสืออิเล็กทรอนิกส์ด้านการเกษตร เฉลิมพระเกียรติพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว

สารละลายด้วยเครื่อง spectrophotometer ที่ความยาวคลื่น 254 นาโนเมตร โดยใช้ 5% HCl เป็น blank คำนวณ
ปริมาณจิบเบอเรลลินที่แบคทีเรียสร้างเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน
2.3 การเพิ่มความเป็นประโยชน์ธาตุอาหารพืช

2.3.1 ความสามารถในการละลายฟอสฟอรัส ศึกษาความสามารถในการละลายฟอสฟอรัสบนอาหารแข็ง

นำแบคทีเรียที่คัดเลือกจากข้อ 2.1 และ 2.2.1 มา streak บนอาหารแข็งเฉพาะของแต่ละสกุล บ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา
เซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นทำ spot inoculation บนอาหารแข็ง Pikovskaya’s medium และ Sundara

Rao Sinha Medium (SRSM) แล้วบ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3, 5 และ 7 วัน จากนั้นตรวจสอบวงใส
รอบโคโลนีที่เกิดขึ้นจากการละลายฟอสเฟตของแบคทีเรีย
2.3.2 ความสามารถในการผลิตสารซิเดอโรฟอร์ (siderophore) โดยนำแบคทีเรียคัดเลือกจากข้อ 2.1 และ
2.2.1 มา streak บนอาหารแข็งเฉพาะของแต่ละสกุล บ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นใช้ลูป
เขี่ยเชื้อที่ปลอดเชื้อแตะโคโลนีของแบคทีเรียมา 1 โคโลนี แล้ว จิ้มบนอาหารแข็ง chrome azurol sulphonate (CAS) ที่
เตรียมโดยวิธีการของ Alexander and Zuberer (1991) แล้วบ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 7 วัน
จากนั้นตรวจสอบวงใสรอบโคโลนี
3. จำแนกสกุลและชนิดโดยวิธีทางสัณฐานวิทยา ชีวเคมี และเทคนิคมัลดิทอฟ (MALDI-TOF)
3.1 การจำแนกโดยวิธีทางสรีระวิทยา ทำการจำแนกแบคทีเรียคัดเลือกจากข้อ 2.1 และ 2.2.1 โดยเลี้ยงเชื้อบน
อาหารแข็งจำเพาะของแบคทีเรียแต่ละสกุล บ่มที่อุณหภูมิประมาณ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นทำการ

ตรวจเช็คลักษณะโคโลนีบนอาหารแข็ง และทำการย้อมสีเซลล์ แบบ different straining และนำไปตรวจดูด้วยกล้อง
จุลทรรศน์กำลังขยาย 1000x

3.2 การจำแนกโดยวิธีทางชีวเคมี ทำการจำแนกแบคทีเรียคัดเลือกจากข้อ 2.1 และ 2.2.1 โดยใช้ API 20NE kit
(BioMerieux, France) นำผลที่บันทึกได้จากการทดสอบไปแปรผลจาก Analytical Profile index
3.3 การจำแนกโดยเทคนิคมัลดิทอฟ (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight: MALDI-
TOF) ทำการจำแนกแบคทีเรียคัดเลือกจากข้อ 2.1 และ 2.2.1 ซึ่งมีขั้นตอนดังนี้
3.3.1 การเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์บนอาหารสูตรจำเพาะหรืออาหารเลี้ยงเชื้อแบบทั่วไป
3.3.2 การสกัดและตกตะกอนโปรตีนของเชื้อจุลินทรีย์ด้วยกรดฟอร์มิกและแอลกอฮอล์
3.3.3 การตกผลึกโปรตีน (crystallization) ด้วย Matrix HCCA, portioned
3.3.4 วิเคราะห์ผลด้วยเครื่องแมสสเปคโตรมิเตอร์ แบบ MALDI-TOF
4. ศึกษาประสิทธิภาพในการส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืชในห้องปฏิบัติการ
ทำการคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพสูง จากข้อ 2 จำนวน 9 ไอโซเลท (Azospirillum 5 ไอโซเลท และ
Azotobacter 4 ไอโซเลท) มาทดสอบประสิทธิภาพในการส่งเสริมการเจริญเติบโตของพืชในห้องปฏิบัติการ ดังนี้
4.1 ทำการทดสอบในหลอดทดลอง ทำการเลี้ยงเชื้อเหลวในอาหารเฉพาะของแต่ละสกุล โดยบ่มที่อุณหภูมิ 30
องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังจากนั้นหยดเชื้อเหลว 0.5 มิลลิลิตร ลงบนเมล็ดข้าวโพด ข้าว และกระเทียมที่ผ่าน
การฆ่าเชื้อในหลอดทดลองขนาดใหญ่ หลังจากนั้นเก็บไว้ในที่มืด อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 วัน นำออกจากที่

มืด เติมน้ำกลั่นนึ่ง 0.5 มิลลิลิตร เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องจนครบ 7 วัน ทำการวัดความยาวรากและความสูงลำต้น
4.2 ทำการทดสอบในขวดแก้ว
4.2.1 ศึกษาประสิทธิภาพในการส่งเสริมการเจริญเติบโตของข้าวโพด วางแผนการทดลองแบบ CRD มี 5 ซ้ำ 7
กรรมวิธี ดังนี้
กรรมวิธีที่ 1 กรรมวิธีควบคุม ไม่ใส่จุลินทรีย์
กรรมวิธีที่ 2 แบคทีเรียที่ใช้ในการผลิตปุ๋ยชีวภาพพีจีพีอาร์ Azospirillum brasilense (DASF04003)
กรรมวิธีที่ 3 แบคทีเรียที่ใช้ในการผลิตปุ๋ยชีวภาพพีจีพีอาร์ Azospirillum brasilense (DASF04005)
กรรมวิธีที่ 4 แบคทีเรีย Azospirillum (AP1)
กรรมวิธีที่ 5 แบคทีเรีย Azospirillum (AP3)

139