Page 152 -

โครงการหนังสืออิเล็กทรอนิกส์ด้านการเกษตร เฉลิมพระเกียรติพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว

2.2 การศึกษาทางชีวเคมี
การศึกษาด้านชีวเคมีของเชื้อสกุล Azospirillum จำนวน 5 ไอโซเลทที่แยกได้ โดยใช้ชุดทดสอบ API 20NE
ซึ่งใช้ในการทดสอบความสามารถในการเปลี่ยนรูปไนโตรเจนและแหล่งคาร์บอนที่เชื้อจุลินทรีย์ใช้ในการเจริญเติบโต จาก

ผลการทดลองพบว่า เชื้อสกุล Azospirillum ทั้ง 5 ไอโซเลท มีความสามารถในการตรึงไนโตรเจนโดยการเปลี่ยนรูป
(รีดิวซ์) NO 3 เป็น N 2O และเปลี่ยนรูป NO 3 เป็น N 2 สอดคล้องกับรายงานของ Alef and Nannipieri (1995) ที่รายงาน
ว่า ความสามารถในการรีดิวซ์ NO 3 เป็น NO 2 พบใน A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, A.
halopraeferens และ A. iraken แต่ความสามารถในการรีดิวซ์ NO 2 ไปเป็น N 2O นั้นพบเฉพาะใน A. lipoferum, A.
brasilense และ A. halopraeferens เท่านั้น นอกจากนี้ยังพบว่า เชื้อสกุล Azospirillum ทั้ง 5 ไอโซเลท สามารถใช้
Esculin ferric citrate, Gelatin (bovine origin), 4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside และ malic acid ในการ
เจริญได้ ดังแสดงในตารางที่ 4 นอกจากนี้ยังพบว่า ไอโซเลท AP1 และ AP3 สามารถเจริญได้ในแหล่งคาร์บอนเดียวกัน
และเมื่อเปรียบเทียบกับเชื้อสกุล Azospirillum ที่ใช้ในการผลิตปุ๋ยชีวภาพพีจีพีอาร์ทั้ง 3 ไอโซเลท (DASF 04003, DASF
04008 และ DASF 04141) พบว่า ทุกไอโซเลทที่แยกได้มีความความสามารถในการตรึงไนโตรเจน การใช้ Esculin ferric
citrate และ 4-nitrophenyl-βD-galactopyranoside ในการเจริญ และยังพบว่า DASF 04003 และ AP7 สามารถใช้
Esculin ferric citrate, Gelatin (bovine origin), 4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside ในการเจริญได้ (ตารางที่

4) ส่วนการศึกษาด้านชีวเคมีของเชื้อสกุล Azotobacter จำนวน 4 ไอโซเลท พบว่า มีความสามารถในการตรึงไนโตรเจน
โดยการเปลี่ยนรูป NO 3 เป็น N 2O และเปลี่ยนรูป NO 3 เป็น N 2 เช่นเดียวกับ DASF04141 ซึ่งเป็นเชื้อมาตรฐานที่ใช้ในการ
ผลิตปุ๋ยชีวภาพพีจีพีอาร์ จำนวน 3 ไอโซเลท คือ AT1, AT9 และ AT10 (ตารางที่ 5) ซึ่งไม่ตรงกับผลการทดสอบ
ประสิทธิภาพในการตรึงไนโตรเจนเบื้องต้น (ตารางที่ 2) นอกจากนี้ยังพบว่า ทุกไอโซเลทสามารถใช้ D-glucose,
L-arginine, Urea และ Esculin ferric citrate ในการเจริญได้เช่นเดียวกับ DASF04141 โดยเฉพาะไอโซเลท AT4 ที่
สามารถใช้ 4-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside ได้เช่นเดียวกับเชื้อมาตรฐานดังแสดงในตารางที่ 5 จากผลการ
ทดลองข้างต้นชี้ให้เห็นว่า เชื้อแบคทีเรียที่แยกได้ทั้งสองสกุลมีความสามารถในการตรึงไนโตรเจนและสามารถใช้ Esculin
ferric citrate ในการเจริญได้เหมือนกัน นอกจากนี้ยังพบว่าแบคทีเรียสกุล Azospirillum สามารถใช้แหล่งคาร์บอนใน
การเจริญได้มากกว่าเชื้อสกุล Azotobacter แต่ไม่สามารถใช้ D-glucose, L-arginine และ Urea ในการเจริญได้
(ตารางที่ 4 และ 5)
2.3 การจำแนกด้วยเทคนิคมัลดิทอฟ (MALDI-TOF)
ผลการทดลองพบว่าค่า score value ของเชื้อแบคทีเรียทั้ง 12 ไอโซเลท อยู่ระหว่าง 1.70. – 1.99 ซึ่งอยู่ใน
เกณฑ์ที่ให้ผลวิเคราะห์ที่หน้าเชื่อถือการจำแนกในระดับสกุล โดยเชื้อที่ใช้ผลิตปุ๋ยชีวภาพพีจีพีอาร์ รหัส DASF 04003

และ DASF 04008 ผลการจำแนกเป็น Azospirillum brasilense รหัส DASF 04141 ผลการจำแนกเป็น Azotobacter
vinelandii ส่วนไอโซเลท AP1 AP3 AP4 AP5 และ AP7 คือ Azospirillum spp. และ AT1 AT4 AT9 และ AT10 คือ
Azotobacter spp. (ตารางที่ 6) การจำแนกชนิดของจุลินทรีย์ด้วยเครื่องแมสสเปคโตรเมทรีโดยใช้เทคนิคมัลดิทอฟ
(MALDI) มีหลักการทำงานคือ เป็นเครื่องมือวิเคราะห์หาน้ำหนักโมเลกุลของสาร ซึ่งเป็นการตรึงโปรตีน (ribosomal
protein) หรือเปปไทด์กับผลึกของ matrix (crystalline matrix) และยิงแสงเลเซอร์ลงบนตัวอย่างโปรตีนให้เกิดการแตก
ตัวเป็นไอออน แล้วเคลื่อนที่ไปตามท่อสุญญากาศที่มีสนามไฟฟ้าเพื่อแยกโมเลกุลของสาร โดยสารที่มวลโมเลกุลน้อยจะ
เคลื่อนที่ไปได้เร็วกว่าสารที่มีมวลโมเลกุลมาก และตกกระทบกับตัวตรวจจับ (detector) ระยะเวลาที่ไอออนเคลื่อนที่ไป
ตกกระทบกับตัวตรวจจับ เรียกกว่า time-of-flight (TOF) มี Software ที่ใช้ในการควบคุมการทำงานของเครื่อง และใช้
ในการประมวลผลทางด้านการวิเคราะห์ บ่งบอก และจัดจำแนกเชื้อ (Identification and Classification for
microorganism) ม ี Reference Library หรือ In-house Library ของ peptide mass fingerprint (PMF) ของ
เชื้อจุลินทรีย์เพื่อใช้ในการเปรียบเทียบข้อมูลที่ได้จากตัวอย่าง (Hosseini and Martinez-Chapa, 2017) ในทางเดียวกัน
มีการประยุกต์ใช้เทคนิคนี้ทางด้านการเกษตรโดยทดสอบศักยภาพของวิธีเพื่อจำแนกชนิดของแบคทีเรียในวงศ์
Rhizobiaceae ได้แก่ Rhizobium, Ensifer Shinella, Mesorhizobium, และ Azorhizobium เปรียบเทียบกับวิธี

144