Page 64 -

โครงการหนังสืออิเล็กทรอนิกส์ด้านการเกษตร เฉลิมพระเกียรติพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว

ประสิทธิภาพการสร้างเอนไซม์เซลลูเลสโดยการวัดเส้นผ่าศูนย์กลางของการเกิดบริเวณใส (clear zone) ในหน่วย
เซนติเมตร (ซม.)/เส้นผ่านศูนย์กลางโคโลนีเชื้อ (ซม.) โดยในการทดสอบนี้ใช้เอนไซม์ cellulase จาก Aspergillus niger
(Sigma) 10 mg/ml (2.41 Unit/ml) เป็น positive control และใช้น้ำกลั่นเป็น negative control

3. การทดสอบประสิทธิภาพของเชื้อราในการละลายฟอสเฟตทำการทดลองสายพันธุ์ละ 3 ซ้ำ
การทดสอบประสิทธิภาพของเชื้อราในการละลายฟอสเฟต (Malviya et al., 2011) เลี้ยงเชื้อราบนอาหารเลี้ยง
เชื้อ PDA บ่มที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 5-7 วัน ขึ้นกับความสามารถในการเจริญของราแต่ละชนิด ทดสอบประสิทธิภาพใน
การย่อยสลายฟอสเฟต ด้วยวิธี spot inoculation บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Pikovskaya’s agar บ่มเชื้อที่อุณหภูมิห้อง
เป็นเวลา 7 วัน จะสังเกตเห็นโซนใสรอบโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ทำการวัดรัศมี ของบริเวณใสและรัศมีของโคโลนี
เพื่อนํามาคํานวณหาความสามารถในการละลาย ดังสูตรต่อไปนี้

ค่าการละลายฟอสเฟต = รัศมีโคโลนี + รัศมีบริเวณใสรอบโคโลนี
รัศมีโคโลนี

4. การทดสอบศักยภาพในการสร้างสารเร่งการเจริญเติบโตทำการทดลองสายพันธุ์ละ 3 ซ้ำ
- การทดสอบและคัดเลือกราที่สามารถสร้างสาร siderophore บนอาหารแข็งสูตร Chrome azurol
S-modified Gaus No.1 (CAS-MGs-1) agar โดยใช้ cork borer ที่ปลอดเชื้อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 มิลลิเมตร
เจาะเส้นใยเชื้อราอายุ 7 วัน ที่เจริญบนอาหาร PDA จากนั้นใช้เข็มเขี่ยย้ายชิ้นวุ้นเชื้อรามาวางบนผิวหน้าอาหารสูตร
CAS-MGs-1 agar โดยวางชิ้นวุ้นราบนอาหารทดสอบสามจุดโดยให้มีระยะห่างเท่าๆ กันนําไปบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา
เซลเซียส เป็นเวลา 14 วัน สังเกตการเปลี่ยนสีรอบจุดที่วางราบนอาหารทดสอบและวัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางปฏิกิริยา
การเปลี่ยนสีที่เกิดขึ้น (Milagres et al., 1999)
- การทดสอบความสามารถของราในการสร้างสารส่งเสริมการเจริญของพืช Indole acetic acid (IAA)
ใช้ cork borer ขนาด ที่ปราศจากเชื้อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 มิลลิเมตร เจาะเส้นใยราอายุ 7 วันที่เจริญบนอาหาร

PDA จากนั้นใช้เข็มเขี่ย ถ่ายชิ้นวุ้นรา จำนวน 2 ชิ้น มาเลี้ยงในอาหารเหลว สูตร Czapek dox medium เติม 2%
L-Tryptophan ที่บรรจุในหลอดทดลองปริมาตร 7 มิลลิลิตร แล้วนําไปเลี้ยงบนเครื่องเขย่าที่ ความเร็วรอบ 150 รอบต่อ
นาที อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นระยะเวลา 7 วัน จากนั้นเก็บสารละลายส่วนใสโดยนําน้ำเลี้ยงเซลล์มาปั่นเหวี่ยงที่
ความเร็วรอบ 10,000 รอบ/นาที ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที เพื่อแยกสารละลายส่วนใส จากนั้นดูด
สารละลายส่วนใสไปทดสอบหาปริมาณ IAA โดยทำปฏิกิริยากับสารละลาย Salkowski reagent ตรวจดูการเปลี่ยนแปลง
ของสีวาเกิดสีชมพูหรือไม่ หากเกิดสีชมพูแสดงวามีการสร้าง IAA (Bric et al., 1991)
5. วิธีการทดสอบความเป็นปฏิปักษ์กับเชื้อราสาเหตุโรคพืชทำการทดลองสายพันธุ์ละ 3 ซ้ำ
เลี้ยงเชื้อราปฏิปักษ์ และเชื้อราสาเหตุโรคพืชในอาหาร PDA เป็นเวลา 2-3 วัน จากนั้นใช้ cork borer
ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 0.5 เซนติเมตร เจาะโคโลนีของเชื้อราปฏิปักษ์ และเชื้อราสาเหตุโรคพืชวางบนอาหาร PDA ใน
จานเลี้ยงเชื้อขนาด 9.0 เซนติเมตร โดยวางห่างจากขอบจานเลี้ยงเชื้อ 2 เซนติเมตร เป็นเวลา 4 วัน หลังจากนั้นนำเชื้อรา
ปฏิปักษ์ที่ต้องการทดสอบมาวางไว้ฝั่งตรงข้ามและห่างจาก ขอบจานเลี้ยงเชื้อ 2 เซนติเมตร บ่มเชื้อที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น
บันทึกผลการยับยั้ง และหาเปอร์เซ็นต์การยับยั้งจากสูตรของ นริศ (2545)
การคำนวณเปอร์เซ็นต์การยับยั้งการเจริญ
เปอร์เซ็นต์การยับยั้งการเจริญ (percent inhibition of radial growth-PIRG) คำนวณได้ดังนี้

R1 – R2
เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง = x 100
R1

R1 = ความยาวรัศมีของโคโลนีเชื้อสาเหตุโรคพืชในจานควบคุม
R2 = ความยาวรัศมีของโคโลนีเชื้อสาเหตุโรคพืชในจานทดสอบ
หาค่าเฉลี่ยความยาวรัศมีของโคโลนีแล้วนำมาคำนวณหาเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง

56